M. Plachot

La fécondation, résultat de l'interaction entre l'ovocyte et le spermatozoïde, est la résultante d'une cascade d'événements qui peuvent à chaque étape être perturbés. Ainsi, des anomalies dans la pénétration des spermatozoïdes dans le cumulus, dans la réaction acrosomique, la liaison et la pénétration de la zone pellucide et la formation des pronuclei conduisent à des échecs de fécondation.

L'absence totale de fécondation peut intervenir après fécondation in vitro conventionnelle (FIV) ou après ICSI (Intracytoplasmic sperm injection). Il peut être inexpliqué, lorsque l'aspect des ovocytes et les caractéristiques du spermogramme sont normaux, ou bien lié à des anomalies gamétiques.

En cas d'échec de fécondation lors d'une première tentative de FIV, et en présence d'une déficience spermatique, une ICSI est généralement proposée la fois suivante, sans que – le plus souvent – des investigations supplémentaires ne soient envisagées. En cas d'échec inexpliqué de fécondation (avec sperme apparemment normal) la qualité d'un ou des deux gamètes peut être impliquée et l'ICSI ne résoudra pas forcément le problème.

L'échec total de fécondation

Dans notre programme de FIV/ICSI, l'échec total de fécondation survient dans environ 4 % des cycles. Ce taux global dépend de la politique du centre concernant le choix des techniques en fonction de l'indication et de la qualité du sperme, FIV ou ICSI, voire 1/2 FIV/ 1/2 ICSI. Il est également fonction du nombre d'ovocytes, le taux d'échecs complets de fécondation étant plus fréquent lorsque  3 ovocytes sont recueillis . Il faut noter que l'absence de transfert est aussi souvent du à une mauvaise qualité embryonnaire qu'à un échec de fécondation car il survient dans environ 10 % des cas dans notre centre.Dans le cadre d'une étude rétrospective sur les paramètres cliniques et biologiques en FIV des couples présentant une stérilité inexpliquée, nous avons observé 6 couples /96 (6 %) qui présentaient un échec complet de fécondation après FIV conventionnelle alors que l'aspect des gamètes était normal.

Quatre d'entre eux ont abandonné après cette première tentative. Un couple a eu ensuite 2 ICSI et un taux de fécondation normal. Nous avons proposé à l'autre de faire FIV et ICSI sur la tentative suivante. Ainsi, les 6 ovocytes microinjectés ont tous été fécondés et sur les 3 ovocytes inséminés, un a été fécondé. L'échec de fécondation en FIV conventionnelle est donc rare dans les stérilités inexpliquées. L'obtention de fécondation après ICSI met en évidence soit des anomalies spermatiques (bien que le spermogramme soit normal) soit des anomalies de la liaison spermatozoïdes-ovocytes. Enfin, bien que le recours à l'ICSI soit maintenant quasi systématique en cas d'échec de FIV, il ne faut pas oublier que dans environ la moitié des cycles, des fécondations sont obtenues à la deuxième FIV après un échec complet de fécondation à la première.

La morphologie ovocytaire

Il existe plusieurs manières d'évaluer la qualité ovocytaire, mais la plus simple est l'évaluation morphologique. Un certain nombre d'ovocytes recueillis après traitement inducteur de l'ovulation sont dysmorphiques et présentent des anomalies de taille, de forme ou de structure telles qu'inclusions cytoplasmiques, granulations ou vacuoles. L'origine de ces anomalies est mal connue et peut être multiple. En effet, il existerait une corrélation entre dysmorphie ovocytaire et caractéristiques biochimiques du liquide folliculaire. Ces anomalies morphologiques pourraient également être associées à l'administration d'un traitement inducteur de l'ovulation, à l'environnement hormonal propre de la patiente ou à des anomalies chromosomiques.

Plus de 20 000 ovocytes recueillis au cours de cycles stimulés ont été analysés dans la littérature à la recherche d'une éventuelle corrélation entre leur aspect morphologique et un certain nombre de paramètres cliniques et biologiques tels que la fécondabilité. Les résultats sont conflictuels. Nous avons donc réalisé une étude multicentrique au cours de laquelle l'aspect morphologique de 1 900 ovocytes a été noté.

Près des 2/3 des ovocytes présentaient un aspect différent de celui de l'ovocyte idéal défini comme ayant un cytoplasme clair, homogène et réfringent, un espace périvitellin réduit, une zone pellucide claire d'environ 15 μm d'épaisseur et un globule polaire intact, rond ou légèrement ovale. Dans notre étude, deux types d'ovocytes avaient un taux de fécondation significativement diminué : ceux ayant un espace périvitellin augmenté- ce qui évoque un début de dégénérescence ovocytaire- et ceux présentant des anomalies multiples. Aucune dysmorphie – a part l'atrésie- n'était associée à un échec complet de fécondation.

L'administration de GH (growth hormone) lors d'un cycle de FIV à des patientes ayant eu précédemment au moins 50 % d'ovocytes dysmorphiques présentant 2 anomalies a amélioré le taux de grossesse sans aucune incidence sur le taux de fécondation (Hazout et al, 2002 ou 2003).

Les anomalies cytoplasmiques

Au cours de la maturation finale de l'ovocyte, des modifications morphologiques, métaboliques et des changements dans l'expression des gènes préparent ce que l'on appelle communément la maturation cytoplasmique. Une biogenèse des mitochondries et une réplication de l'ADN mitochondrial permettent, via les phosphorylations oxydatives de fournir de l'ATP à l'ovocyte. Reynier et al (2001) ont comparé plusieurs groupes d'ovocytes provenant d'échecs de fécondation pour évaluer leur contenu en ADN mitochondrial (ADN mt).

Ainsi, le nombre moyen de copies d'ADN mt par ovocyte est de 193 000 ± 122 000 (sur 113 ovocytes analysés) avec une grande variabilité (20 000 à 598 000) même au sein d'une même cohorte. Cette variabilité a été observée par tous les auteurs. Les ovocytes non fécondés provenant d'une insémination avec un sperme déficient contenaient plus d'ADN mt (255 000 ± 110 000) que ceux provenant d'une insémination avec un sperme normal (152 000 ± 90 000, p< 0.0001). Qui plus est, en comparant les ovocytes non fécondés provenant d'une cohorte avec échec complet de fécondation avec ceux d'une cohorte ayant un taux de fécondation normal, le nombre de copies d'ADN mt est là encore différent (152 000 ± 90 000 vs 209 000 ± 122 000, p<0.02). C'est d'ailleurs d'une cohorte d'échec complet de fécondation que provenaient 6 des 7 ovocytes ayant moins de 50 000 copies d'ADN mt.

Cette étude montre donc que la quantité d'ADN mt joue un rôle dans la fécondabilité des ovocytes. Ces différences dans la biogenèse mitochondriale reflètent vraisemblablement des variations dans le degré de maturation cytoplasmique. C'est la raison pour laquelle certains ont proposé des dons de cytoplasme, c'est-à-dire la microinjection d'une faible quantité de cytoplasme (15 μl) provenant d'un ovocyte sain dans un ovocyte supposé déficient. Des grossesses ont été obtenues mais outre les problèmes éthiques qu'elle soulève, cette technique n'a pas fait réellement la preuve de son efficacité (St John, 2002).

Autres anomalies ovocytaires

D'autres anomalies ovocytaires peuvent être responsables d'un échec de fécondation sans toutefois, le plus souvent, intéresser toute la cohorte. C'est le cas des anomalies de la zone pellucide (zona hardening), qui s'exprime par une modification du poids moléculaire des glycoprotéines de la zona , ainsi que des anomalies cytoplasmiques caractérisées par un faible nombre de granules corticaux (Ducibella et coll, 1995) ;

L'interaction ovocyte-spermatozoïde

L'interaction ovocyte-spermatozoïde est essentielle pour obtenir une fécondation en FIV conventionnelle. Liu et Baker (2000) ont analysé la liaison des spermatozoïdes à la zone pellucide des ovocytes non fécondés. Ils ont défini 4 groupes d'ovocytes non fécondés en fonction du taux de fécondation de la cohorte : 0 %, 1-25 %, 26-50 %, 51-95 %. Ainsi, dans le groupe avec 0 % de fécondation, 70 % des ovocytes avaient moins de 5 spermatozoïdes fixés sur la zone pellucide alors que ce taux n'était que de 17 % dans le groupe avec 50-95 % de fécondation. L'incubation des ovocytes du 1er groupe avec des spermatozoïdes de donneur permet d'obtenir un taux normal de fixation, montrant que la l'anomalie se situait au niveau spermatique.

La fécondance des spermatozoïdes

L'ICSI a montré que des fécondations peuvent être obtenues dans des situations d'oligo-asthéno-tératospermie extrême, et que le facteur limitant était généralement la qualité de l'ovocyte. En FIV conventionnelle, il n'en est pas de même. L'examen de base reste le spermogramme, qui certes, donne une indication sur les potentialités fécondantes du sperme, sans pour autant prédire avec exactitude la fécondance d'un sperme donné. Il existe cependant de rares cas tels que l'akinésie totale, ou une tératospermie à 100 % avec par exemple une globozoospermie qui conduisent généralement à un échec total de fécondation. D'autres tests, fonctionnels, ont donc été mis au point : test de pénétration des ovocytes de hamster dépellucidés (tombé en désuétude), analyse du mouvement, tests appréciant la réaction acrosomique, test de fixation à la zone pellucide pour n'en citer que quelques-uns.

Même s'ils cernent mieux la fécondance du sperme, aucun ne permet de dire avec certitude qu'un sperme sera fécondant ou non, et ne permet pas de faire l'économie d'une FIV, seul « test » valable. Le dernier en date de ces tests est l'étude de la fragmentation de l'ADN spermatique, qui, comme les autres semble corrélé à la fécondance du sperme (sans pour autant la prédire), mais également à sa capacité à engendrer un embryon viable (Benchaib et coll, 2003).

Le devenir du noyau mâle

Si l'on peut comprendre l'échec de fécondation en FIV conventionnelle, le plus souvent du à l'absence de pénétration du spermatozoïde dans l'ovocyte, il n'en est pas de même pour l'ICSI où le spermatozoïde est injecté directement dans l'ovocyte. L'absence de formation du pronucleus mâle pose le problème de ce qu'est devenu le noyau du spermatozoïde. Pour répondre à cette question depuis de nombreuses années nous réalisons une fixation des ovocytes apparemment non fécondés par la technique de Tarkowski (). Cette technique simple est riche d'informations :

– Si le spermatozoïde est absent, c'est un échec de la technique elle-même. Il arrive en effet que le spermatozoïde soit expulsé à l'extérieur (dans l'espace périvitellin) lors du retrait de la micropipette.

– Si le noyau du spermatozoïde est intact ou présente des degrés divers de décondensation, l'ovocyte ou le spermatozoïde peuvent être responsables. L'ovocyte s'il présente un déficit en MPGF (male pronucleus growth factor), ou le spermatozoïde s'il présente des anomalies de la décondensation de la chromatine.

– Si le spermatozoïde a formé une PCC (premature chromosome condensation) on voit l'ADN du spermatozoïde sous forme de longues et fines chromatides (Plachot et Crozet, 1992). Dans ce cas, la maturité cytoplasmique de l'ovocyte est mise en cause. Cela a été montré par Calafell et al () chez la souris. En effet, le taux de PCC, nul dans les ovocytes mûrs, était d'autant plus élevé que l'ovocyte était immature. Un taux de PCC répétitivement élevé dans les ovocytes est de mauvais pronostic et doit être expliqué au couple qui doit décider ou non de poursuivre les tentatives.Comment y remédier ?

L'ICSI du lendemain

En cas d'échec de FIV, certains ont proposé l'ICSI du lendemain, avec toutefois des résultats peu concluants. En effet, si des fécondations et des développements embryonnaires précoces peuvent ainsi être obtenus, seules quelques rares grossesses ont été rapportées dans la littérature. Kuczynski et al (2002) ont comparé rétrospectivement les résultats de l'ICSI réalisé 24h après la ponction chez 120 couples ayant eu un échec complet de FIV, avec un groupe témoin de 280 couples ayant eu une ICSI en première intention dans la même période. Le taux de fécondation et le pourcentage d'embryons présentant 4 cellules à J2 après ICSI étaient significativement supérieurs dans le groupe témoin (p<0.05). L'aspect morphologique des embryons était identique dans les 2 groupes. Le taux de grossesse du groupe témoin était de 25.3 % alors qu'aucune grossesse n'est survenue dans le groupe ayant eu une ICSI de sauvetage. Les auteurs découragent l'utilisation de cette technique. Le vieillissement de l'ovocyte semble être en cause dans l'incapacité des embryons à s'implanter et à permettre un développement à terme.

Tout ICSI ou mi-FIV mi-ICSI à la deuxième tentative

La solution de facilité après un échec de FIV est de proposer tout ICSI à la deuxième tentative. Si cette solution est la plus efficace, elle n'est pas la plus satisfaisante puisque l'on sait que des fécondations peuvent être obtenues en FIV après un 1er échec. C'est pourquoi nous avons proposé de partager les ovocytes entre FIV et ICSI si au moins 6 ovocytes étaient recueillis.

L'activation de l'ovocyte

Eldar-Geva et al (2003) ont rapporté le cas d'un couple ayant une stérilité inexpliquée depuis 5 ans et ayant eu plusieurs échecs de fécondation après ICSI. L'activation des ovocytes par le calcium ionophore A 23187 après microinjection a permis d'obtenir un taux raisonnable de fécondation au cours de 3 cycles (4/6, 5/16, 7/20). Deux grossesses ont été obtenues, la première s'est terminée par une FCS du deuxième trimestre à cause d'une anomalie fœtale et la seconde par la naissance de 3 enfants en bonne santé.Echec total d'ICSI

Dans environ 3 % des cycles d'ICSI, il n'y a aucune fécondation. Cet échec peut s'expliquer par différents facteurs liés à l'ovocyte (ovocytes en faible nombre ou en voie d'atrésie) ou au sperme et tout particulièrement l'akinétospermie (spermatozoïdes immobiles) et la globozoospermie (spermatozoïdes à tête ronde).

Bibliographie

[1] Benchaib M, Braun V, Lornage J, Hadj S, Salle B, Lejeune H, Guérin JF Sperm DNA fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique. Hum Reprod 2003; 18 : 1023-1028.

[2] Ducibella T, Dubey A, Gross V, Emmi A, Penzias AS, Layman L, Reindollar R. A zona biochemical change and spontaneous cortical granule loss in eggs that fail to fertilize in in vitro fertilization. Fertil Steril 1995 ; 64 : 1154-1161.

[3] Eldar-Geva T, Brooks B, Margalioth EJ, Zylber6haran E, Gal M, Silber SJ. Successful pregnancy and delivery after calcium ionophore oocytes activation in a normozoospermic patient with previous repeated failed fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 2003 ; 79 (suppl 3) : 1656-1658.

[4] Kuczynski W, Dhont M, Grygoruk C, Pietrewicz P, Redzko S, Szamatowicz M. Rescue ICSI of unfertilized oocytes after IVF. Hum Reprod, 2002 ; 17 : 2423-2427.

[5] Liu DY, Baker HWG. Defective sperm-zona pellucida interaction : a major cause of failure of fertilization in clinical in-vitro fertilization. Hum Reprod, 2000 ; 15 : 702-708.

[6] Plachot M, Crozet N. Fertilization abnormalities in human in-vitro fertilization. Hum Reprod 1992 ; 7 : 89-94.

[7] Reynier P, May-Panloup P, Chrétien MF, Morgan CJ, Jean M, Savagner F, Barrière P, Malthièry Y. Mitochondrial DNA content affects the fertilizability of human oocytes. Mol Hum Reprod 2001, 7: 425- 429.

[8] St John JC. The need to investigate the transmission of mitochondrial DNA following cytoplasmic transfer. Hum Reprod 2002 ; 17 : 1954-1958.

[9] Tarkowski AK. An air-drying method for chromosome preparations from mouse eggs. Cytogenetics 1966 ; 5 : 39-44.

[10] Calafell JM, Badenas J, Catala V, Egozcue J, Santalo J. Premature chromosome condensation (PCC) as a sign of oocyte immaturity. Hum Reprod

[11] Plachot M, Selva J, Wolf JP, Conséquences d'une dysmorphie ovocytaire sur la fécondation et le développement embryonnaire après injection intracytoplasmique d'un spermatozoïde. Une étude prospective multicentrique. Gynécol Obstet Fertil 2002 ; 30 : 772-779.

[12] Hazout A, Junca AM, Tesarik J, Menezo Y. Effet pomoteur de l'hormone de croissance sur la competence des ovocytes dysmorphiques : résultats d'une étude pilote randomisé en double aveugle. Ref Gynecol Obstet 2000 ; 10 : 71-77.